Recent advances in the study of avian malaria: an overview with an emphasis on the distribution of Plasmodium spp in Brazil

Avian malaria parasites (Plasmodium) have a worldwide distribution except for Antarctica. They are transmitted exclusively by mosquito vectors (Diptera: Culicidae) and are of particular interest to health care research due to their phylogenetic relationship with human plasmodia and their ability to cause avian malaria, which is frequently lethal in non-adapted avian hosts. However, different features of avian Plasmodium spp, including their taxonomy and aspects of their life-history traits, need to be examined in more detail. Over the last 10 years, ecologists, evolutionary biologists and wildlife researchers have recognized the importance of studying avian malaria parasites and other related haemosporidians, which are the largest group of the order Haemosporida by number of species. These studies have included understanding the ecological, behavioral and evolutionary aspects that arise in this wildlife host-parasite system. Molecular tools have provided new and exiting opportunities for such research. This review discusses several emerging topics related to the current research of avian Plasmodium spp and some related avian haemosporidians. We also summarize some important discoveries in this field and emphasize the value of using both polymerase chain reaction-based and microscopy-based methods in parallel for wildlife studies. We will focus on the genus Plasmodium, with an emphasis on the distribution and pathogenicity of these parasites in wild birds in Brazil.

A expressão de WARP, um alvo potencial para Vacinas de Bloqueio de Transmissão, durante o desenvolvimento sexual de Plasmodium gallinaceum

Durante o ciclo de vida dos parasitos causadores da malária, uma das fases cruciais é o desenvolvimento sexual e a conseqüente invasão do epitélio intestinal do hospedeiro invertebrado. Proteínas dos estágios do ciclo esporogônico podem ser alvos para vacinas Bloqueadoras de Transmissão (TBVs). Uma das proteínas micronemais que já demonstrou ser um alvo promissor para a inibição do desenvolvimento de oocistos e, portanto, da transmissão, é a WARP (von Willebrand Factor A Domain Related Protein), uma proteína secretada, aparentemente envolvida com a adesão e locomoção dos parasitos. Estudos recentes demonstraram que WARP é sujeita à repressão traducional em macrogametócitos de P. berghei, com o seu mRNA sendo silenciado pela proteína DOZI através da formação de uma ribonucleoproteína. Os objetivos deste estudo foram i) Analisar o perfil de expressão da proteína WARP nos estágios sexuais de P. gallinaceum, ii) Comparar o perfil de transcrição de WARP, durante o desenvolvimento sexual, com perfis de alguns genes relacionados à regulação da expressão ou à invasão epitelial, e iii) Avaliar o potencial da proteína WARP como um candidato à vacina através da análise do seu padrão de expressão.

O domínio vWA de PfWARP foi produzido como uma proteína recombinante que foi usada para a produção de anticorpos policlonais. Foram realizados experimentos de microscopia confocal usando estes anticorpos para se detectar WARP em estágios sexuais cultivados de P. gallinaceum. RT-PCR foi usada para detectar WARP e os outros genes estudados a partir de amostras de sangue contendo gametócitos e a partir de intestinos de Aedes fluviatilis infectados, coletados até 24 horas após a alimentação. A proteína WARP pode ser detectada desde os estágios iniciais do desenvolvimento de oocinetos, em zigotos recém-fertilizados, até as formas maduras alongadas. Em zigotos, sua expressão parece ser intra-vesicular e localizada na periferia citoplasmática, próxima à membrana celular, e em oocinetos maduros, WARP apresenta uma distribuição granular com concentração focal na região apical, corroborando sua localização micronemal. Seu transcrito foi detectado, por RT-PCR, em gametócitos de P. gallinaceum. Ainda, o transcrito para a proteína PgDOZI também foi detectado em gametócitos, indicando que a repressão traducional possa ser um mecanismo de regulação gênica também nesta espécie, e que WARP seja, provavelmente, um de seus alvos de regulação. Esta é a primeira vez que a proteína WARP é detectada tão prematuramente durante o desenvolvimento de oocinetos e a primeira evidência de expressão dos genes DOZI, α-Tubulina e MAOP em P. gallinaceum.

Análise de desempenho de mosquitos Aedes fluviatilis (Lutz, 1904) transgênicos expressando a fosfolipase A2 mutada do veneno de abelhas

A manipulação genética de insetos é uma alternativa às formas usuais de interferência, como por exemplo, o uso de inseticidas. Utilizando esta ferramenta podemos inserir, em insetos, genes que possuem a capacidade de bloquear parasitas. Estudos mostraram que a proteína fosfolipase A2 (PLA2) de venenos animais inibia a formação de ocistos de espécies de Plasmodium, se tornando uma ótima candidata para expressão em mosquitos transgênicos a fim de reduzir a transmissão do parasita. Contudo, ao expressar a PLA2 em mosquitos, observou-se que o desempenho biológico dos insetos foi prejudicado. A fim de contornar esse problema foram realizadas mutações no sítio ativo da enzima inativando-a, sem alterar sua capacidade de bloqueio de desenvolvimento de parasitas. Essa molécula de bloqueio (PLA2m) foi expressa em Aedes fluviatilis, vetor em laboratório do parasita causador da malária de aves. Ensaios prévios de avaliação de inibição do parasita e caracterização molecular das linhagens transgênicas (4T, 8T, 9T e 10T) não confirmaram se a PLA2m prejudicava o desempenho dos mosquitos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o desempenho biológico destes mosquitos. Fêmeas da linhagem 8T apresentaram longevidade significativamente maior que o controle; em machos, a longevidade das linhagens 8T, 9T e 10T foi maior que a do controle.

A fecundidade das fêmeas transgênicas foi igual à das fêmeas do grupo controle, porém a fertilidade das linhagens 4T, 8T e 10T foi menor (em porcentagem) que a do controle. A freqüência do transgene se manteve alta por várias gerações, mostrando que o mosquito transgênico se mantém persistente. Houve desvios de razão sexual nos transgênicos, quase sempre para maior proporção de machos. Não houve diferença significativa na susceptibilidade ao inseticida organofosforado Temefós entre as linhagens transgênicas e controle. Com relação à atividade das enzimas que detoxificam inseticidas, apenas a linhagem 4T apresentou atividade de acetilcolinesterase parcialmente alterada em relação ao controle. Entretanto, as outras linhagens mantiveram-se sensíveis. Para a alfa, beta e PNPA esterases, oxidases de função mista e glutationa S-transferase, todas as linhagens transgênicas mantiveram-se sensíveis. Podemos concluir que a PLA2m não interferiu nos parâmetros biológicos avaliados nos mosquitos transgênicos. Estes resultados a colocandom como uma forte candidata para ser expressa em mosquitos anofelinos vetores de parasitas da malária humana

Susceptibilidade e resposta imune humoral do hospedeiro natural Gallus gallus domesticus a esporozoítas de Plasmodium gallinaceum (Brumpt, 1935)

Investigou-se a susceptibilidade da galinha doméstica, hospedeiro natural do Plasmodium gallinaceum (Pg), aos esporozoítas inoculados por diferentes vias, bem como a sua capacidade de produzir anticorpos anti-esporozoítas. Aves de uma ou três semanas de idade foram inoculadas com esporozoítas pela picada de Aedes Fluviatilis, pela via subcutânea (s.c.) ou intravenosa(i.v.) e as parasitemias acompanhadas através de esfregaços sanguíneos diários. Nas aves de uma semana inoculadas pela picada de Aedes ocorreu 100 por cento de infecção, enquanto nas aves de três semanas ocorreu variação de 40 a 100 por cento, proporcional ao número de fêmeas alimentadas. A inoculação de esporozoítas pela seringa resultou em 100 por cento de infecção. O período pré-patente (PPP) da malária foi menor na inoculação i.v., no entanto, a idade da ave não influenciou o PPP. Aves mais jovens tiveram maiores parasitemias e mortalidades. Nos soros coletados após a primoinoculação, anticorpos anti-esporozoítas foram detectados pela imunofluorescência indireta (IFI) nos dias 7 e 14 após inoculação, declinando na terceira semana.Na Elisa com esporozoítas isolados de mosquitos, os soros foram positivos a partir da terceira semana. Nas três reinoculações de esporozoítas, os títulos de anticorpos atingiram um platô após o segundo inóculo. As aves inoculadas pelas tr~es vias apresentaram títulos similares ao final das reinoculações, embora as que foram inoculadas pela picada apresentaram maior aumento no título de anticorpos. Pelas análises de western-blot com sedimento ou antígenos solúveis de esporozoítas, a proteína circumesporozoíta (cs) foi reconhecida pelos soros de aves inoculadas por qualquer das três vias utilizadas, a partir da segunda semana após inoculação. Outras proteínas de variados pesos moleculares foram também reconhecidas, algumas pertencentes a antígenos obtidos de Aedes não infectados, entre elas uma proteína de 7 kda.

No modelo aviário, o hospedeiro natural produziu anticorpos contra os antígenos de esporozoítas com elevados títulos e prevalência, tendo a proteína CS confirmado a sua imunogenicidade. A possível presença de anticorpos protetores nos soros de aves expostas aos esporozoítas e o estudo das diferenças qualitativas entre os esporozoítas inoculados pela picada e seringa, suas conseqüencias na interação parasita-hospedeiro e resposta imune subseqüente necessitam ser melhor estudadas no futuro.